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    PCR仪百科简介

    2013-08-19 10:09:12  来源:爱仪器仪表网

    摘要:简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内InVitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。

      PCR简介

      PCR的要素

      基本的PCR须具备

      1.要被复制的DNA模板 Template

      2.界定复制范围两端的引物Primers.

      3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

      4.合成的原料(四种脱氧核苷酸)及水。

      PCR仪工作原理

      利用升温使DNA变性,用限制性内切酶使DNA双链解链,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的

      PCR的反应包括三个主要步骤

      分 别是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热(至90~95℃)变性, 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下(冷却至55~60℃)附着于模板DNA两端。 *后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加热至70~75℃)进行引物的延长 Extension of primers及另一股的合成。

      PCR的*早设想核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年*早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

      PCR的实现

      1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制

      PCR的改进与完善

      Mullis*初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是:

      ①Klenow酶不耐高温, 90℃会变性失活,每次循环都要重新加。

      ②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的

      DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,

      但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成

      一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引

      起生物医学界的足够重视。

      1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较

      高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。

      1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种

      耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的

      90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40

      %。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异

      性和扩增效率,增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也

      大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA多聚酶Taq DNA

      Polymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

      PCR仪的分类

      普通的PCR仪

      把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,叫传统的PCR仪,也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的,对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科研研究,教学,医学临床,检验检疫等机构。

      梯度PCR仪

      把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常有12种温度梯度,这样的仪器就叫梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段,其*适退火温度事不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增,就可以筛选出表达量高的*适退火温度,进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间。主要用于科研,教学机构。梯度PCR仪,在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。

      原位PCR仪

      用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪,如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增,不但可以检测到靶DNA,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。

      实时荧光定量PCR仪

      在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同,只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)。荧光定量PCR仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测,生物医药研发,食品行业,科研院校等机构。

      获得诺贝尔奖的PCR技术

      1995年,美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖,他所取得的成就是发明了PCR技术。

      PCR,中文译为聚合酶链式反应,其实是一种DNA的快速扩增技术,其扩增效率之高就象核裂变的“链式反应”那样。PCR技术通过两个短的称为引物的 DNA小片段和一种耐热的酶的作用,可以在3个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。这种技术一问世,立刻引起了分子生物学研究的一场革命,人们利用 这种轰动全世界的技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说,PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破,而且随着PCR技术的 日趋完善,PCR在人类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“DNA指纹” 中我们提到,科学家们只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成DNA指纹的鉴定工作,这里实际上就要采用PCR技术,因为一个细胞中的DNA含量实在太少 了,人们根本不可能检测到它的指纹;有了PCR技术就好办了,通过PCR技术把这个细胞中的DNA片断扩增1000万倍,这样DNA量就足够作指纹鉴定了。 再比如,在医院里检验血液中的某种病毒,有时病毒量极少(例如有的艾滋病病毒携带者),通过传统的检查方法费力又费时,这时PCR技术也许就可以帮上忙。 可以先选定这种病毒DNA上的一段DNA,设计合适的引物DNA,然后通过PCR技术一扩增很快就可以判断出血样中是否扩增出了大量的DNA,如果是的 话,那么就说明血样中带有该种病毒了。PCR方法不但有极高的灵敏度,而且可以同时一次做近百个扩增反应,省时省力效率高。

      PCR技术神奇就神奇在以下几个特点上:一是被扩增的DNA所需量极小,理论上讲一个分子就可以用于扩增了;二是扩 增效率高,目的基因的量成指数形式扩增,几个小时就扩增1000万倍以上。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监 测等诸多方面,真不愧是“获得诺贝尔奖”的好技术!


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